Tuż po ślubach zakonnych Jan został wysłany na studia filozoficzne i teologiczne do Salamanki. Tamtejszy uniwersytet był wówczas jednym z czterech najważniejszych w Europie – obok uczelni w Sorbonie, Oksfordzie i Bolonii. Jan od Krzyża był wielkim mistykiem, ale
jego życie duchowe miało solidną podstawę teologiczną.
Uniwersytet w Salamance jest dzisiaj uczelnią, którą najchętniej wybierają zagraniczni studenci przyjeżdżający do Hiszpanii w ramach programu Socrates-Erasmus. Główny budynek, pochodzący z XV wieku, zachował się w nienaruszonym stanie.